对一个生命体的基因组进行重新设计并合成有助于我们理解许多关于DNA序列必要性、基因组调控和进化等重要生物学问题。尽管在过去的二十年中，我们的DNA合成能力显著提升，但准确高效地构建出含有百万碱基对规模的DNA片段仍然是极大的挑战。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是第一个被测序的真核生物，至此之后酵母的遗传研究得到了快速的发展。在此背景下更进一步，合成酵母基因组项目（Sc2.0）是目前最庞大的真核生物合成基因组项目，该项目旨在通过去除逆转座子和其他重复序列来增加基因组稳定性，评估当整个基因组被“随机重排”后合成型酵母是否能够获得新的性质。

        2023年11月8日，纽约大学医学院Jef D. Boeke，中国科学院深圳先进技术研究院戴俊彪，东京工业大学Yasunori Aizawa课题组合作（第一作者为张维民）在Molecular Cell发表长文Manipulating the 3D organization of the largest synthetic yeast chromosome，报道人工合成迄今为止最长真核生物（酵母）染色体，并通过操控其三维空间结构实现对整条合成染色体的转录抑制。作者首先通过对前人方法的改进，大大提高了合成145万碱基对染色体的效率和灵活性。并通过重置着丝粒和锚定合成型染色体到内核膜两种方式操控该合成染色体的空间结构，实现了对其三维空间结构的人工定义。

       为了提高拼接百万级碱基对染色体的效率，作者将设计完成后携带有上千处编辑的合成型四号酵母染色体 (synIV)  大致平均分割成了11段，然后从11个菌株开始并行拼接。这么做是为了降低因不可预测的设计漏洞而导致的进度停滞。当确保所有中间菌株都含有目标合成型染色体片段，并且菌株健康测试达标之后，再利用酵母减数分裂重组（Meiosis Recombination-mediated Assembly, MRA）将两两片段合并，最终经过多轮MRA获得全长synIV（图一）。

图一，酵母合成型四号染色体（synIV）的设计与拼接策略

       酵母染色体在细胞核内形成动态但有规则的空间结构，目前人们对酵母染色体的改造尚停留在DNA序列层面，对染色体三维空间结构的设计和操控还是空白。本文作者在合成完synIV的一级序列之后，通过重置着丝粒（CEN4）位置，将synIV在空间上相对于其他15条染色体进行了翻转，从而造成synIV上携带的近800个基因都会发生空间上的变化，原有的染色体间的相互作用也会被打破并重新建立（图二）。我们知道高等生物基因表达受拓扑结构域（Topologically Associating Domain）调控，那么酵母细胞核中是否也存在类似的调控机制呢？针对这个问题先前的一些研究得出矛盾甚至相反的结论【1-3】。本文作者分别对空间结构翻转前后的synIV进行RNA-seq，发现在转录组层面两者并没有显著差异，证明在酵母细胞核内部空间里拓扑结构域对基因表达的调控微乎其微。

图二，synIV空间翻转示意图以及Hi-C实验验证

       酵母细胞核内核膜区域常常聚集基因沉默调控（SIR）家族蛋白，形成转录抑制区【4】，本文作者基于合成染色体上均匀分布的479个相同序列的loxPsym位点（每个34 bp），希望将synIV锚定在内核膜区，从而抑制整条染色体的基因表达。就此，作者首先利用一种人工智能模型ZFDesign【5】，设计出可以特异结合loxPsym序列的锌指蛋白，通过将此锌指蛋白与内核膜蛋白HEH1和HEH2的C端融合，特异性地将synIV “抓”到内核膜上。果然，被锚定到内核膜上的synIV菌株具有生长弱势，RNA-seq结果证明大部分下调的基因来自synIV。作者又将这个锚定系统用到了只有一半区域是合成型的synIV 菌株（semi-synIV）以及三号合成型染色体（synIII），都实现了对合成型区域内基因的转录抑制。另外一个巧妙的设计是该锌指蛋白的表达是受雌二醇诱导，当作者将酵母生长环境中的雌二醇去除之后，这种对合成型染色体的转录抑制也会随即消失。

图三，锚定synIV到内核膜上的设计示意图

       综上，本文首先人工合成了迄今为止最长的真核生物（酵母）染色体，在技术上的创新为将来对更庞大的基因组的设计和重构提供了支持。其次通过对synIV空间结构的操控，证明了酵母细胞核内部空间里拓扑结构域对基因表达的调控十分有限。最后利用synIV上数百个loxPsym位点将synIV “抓”到内核膜上的转录抑制区，实现了在不改变DNA序列的前提下，对合成片段上基因表达的灵活控制。

       本文第一作者张维民于2012-2017年期间博士就读于清华大学生命科学学院，现任职于纽约大学医学院系统遗传学研究所研究型助理教授。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.10.015

参考文献

1. Hsieh, T.-H. S. et al. Mapping Nucleosome Resolution Chromosome Folding in Yeast by Micro-C. Cell 162, 108–119 (2015).

2. Homouz, D. & Kudlicki, A. S. The 3D Organization of the Yeast Genome Correlates with Co-Expression and Reflects Functional Relations between Genes. PLOS ONE 8, e54699 (2013).

3. Janga, S. C., Collado-Vides, J. & Babu, M. M. Transcriptional regulation constrains the organization of genes on eukaryotic chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 15761–15766 (2008).

4. Taddei, A. & Gasser, S. M. Structure and function in the budding yeast nucleus. Genetics 192, 107–129 (2012).

5. Ichikawa, D. M. et al. A universal deep-learning model for zinc finger design enables transcription factor reprogramming. Nat. Biotechnol. (2023) doi:10.1038/s41587-022-01624-4.